Млинівський Державний Технолого-Економічний коледж

Тема №24. Методи зберігання сперми різних видів тварин. Транспортування сперми.

План

1.Основні принципи і практичне значення зберігання сперми.

2.Техніка короткочасного зберігання розбавленої сперми.

3.Теоретичні основи заморожування сперми і тривале її зберігання.

4.Обладнання для заморожування, зберігання і транспортування сперми.

 

1. Основні принципи і практичне значення зберігання сперми. Питання про способи зберігання сперми виникло одночасно з початком застосування штучного осіменіння, оскільки взята від плідника сперма перебуває певний час поза організмом. У сперміях порівняно з іншими клітинами організму переважають процеси дисиміляції над процесами асиміляції. Внаслідок цього спермії швидко втрачають запас енергетичних речовин і гинуть. Проте ще задовго до загибелі, спермії, зберігаючи рухливість, втрачають найважливішу властивість — запліднювати яйцеклітини. Крім того, спермії нездатні засвоювати з навколишнього середовища поживні речовини, тому тривалість їхнього життя залежить від двох факторів: життєвих ресурсів самих клітин та швидкості витрачання їх. Отже, щоб подовжити життя 45 сперміїв, треба підвищити їхню життєздатність і сповільнити або загальмувати їхній обмін речовин з навколишнім середовищем, тобто перевести спермії в стан анабіозу, який буває повним і неповним. При повному анабіозі в сперміях біохімічні процеси не відбуваються, але зберігається їхня життєздатність, тобто властивість відновлювати повну життєздатність у нормальних умовах існування. При неповному анабіозі обмінні процеси значно гальмуються, але не припиняються. Слід зазначити, що це явище загально-біологічне. Спосіб зберігання сперми у висушеному стані поки що розробляється. Він перспективний, оскільки при зберіганні висушеної сперми немає потреби в кріогенному обладнанні, охолоджувачах тощо. У сучасних умовах при організації зберігання сперми основного поширення набули обидва різновиди температурного анабіозу. Проте незалежно від форми анабіозу зберігати сперму треба так, щоб максимально використати цінних племінних плідників, здійснювати науково обґрунтований індивідуальний підбір тварин незалежно від їхнього територіального розміщення, правильно використовувати плідників для взяття від них сперми високої якості.

 

2.Техніка короткочасного зберігання розбавленої спермии. Існує кілька способів зберігання сперми поза організмом: короткочасне зберігання сперми бугая, барана та жеребця при температурі 2-4cС; зберігання сперми бугая, барана і кнура за допомогою інактивації сперміїв кислотами; зберігання сперми кнура в середовищах, що містять хелатон; тривале зберігання сперми бугая, барана і жеребця в рідкому азоті. Техніка короткочасного зберігання розбавленої спермии. Цей спосіб використовують для зберігання сперми всіх видів тварин. Нині сперму бугаїв зберігають тільки у замороженому стані, однак попередньо перед заморожуванням її короткочасно зберігають також при температурі, близькій до 0c С. Оптимальна температура при короткочасному зберіганні сперми має бути 2-4c С. Однак при охолодженні сперми до цієї температури слід враховувати можливість холодового удару сперміїв.

  Щоб уникнути цього негативного впливу, застосовують поступове, повільне охолодження. Чим повільніше охолоджується сперма, тим менша небезпека холодового удару. Однак не можна охолоджувати сперму і дуже повільно, оскільки при цьому в ній нагромаджується багато молочної кислоти, яка отруює спермії; чим густіша сперма, тим швидше нагромаджується молочна кислота. Тому швидкість охолодження сперми має бути оптимальною, що дає змогу уникнути холодового удару та підкислення її. Іншим способом захисту сперміїв від холодового удару є доливання до сперми жовтка курячого яйця. Лецитин, який міститься в жовтку та його сполуки з білками мають властивість пом'якшувати прояви холодового удару. Однак при швидкому охолодженні повністю ліквідувати холодовий удар сперміїв за допомогою жовтка неможливо.

  Отже, дуже швидко охолоджувати сперму не можна. 46 Однією з вимог для забезпечення умов короткочасного зберігання сперми є стала температура — 2-4c С. Таку температуру можна створити у побутовому холодильнику або звичайному харчовому широкогорлому вакуумному термосі з талим льодом. Температуру в холодильнику контролюють за допомогою термометра. На випадок можливих коливань температури рекомендується поставити на полицю холодильника посудину з талим льодом, а в неї помістити флакони з охолодженою спермою. Термос перед використанням для зберігання сперми заповнюють кусками льоду (розміром з волоський горіх) приблизно до половини його об'єму. Лід, щойно взятий знадвору або з холодильника, потрібно облити теплою водою, щоб він почав танути. Поверх льоду кладуть кружок з поліетиленової плівки і тонкий шар (0,5 см) вати. Плівка захищає вату від намокання, а вата потрібна для рівномірно-сповільненого охолодження сперми. Взяту від плідника сперму негайно оцінюють за густотою та активністю сперміїв, визначають концентрацію їх. Оцінювати сперму потрібно якомога швидше, для того щоб не допустити накопичення в ній кислих продуктів розпаду. Сперму жеребця і кнура перед оцінкою проціджують крізь 2-3 шари стерильної марлі в чисту теплу скляну посудину для відокремлення тягучих секретів придаткових статевих залоз. Відразу після оцінки сперму розбавляють одним з розріджувачів (для певного виду тварин), що містить жовток. При доливанні розріджувача у сперму захисна дія жовтка виявляється не відразу, а лише через кілька хвилин після розбавляння. Тому розбавляти сперму холодним розріджувачем не можна, оскільки спермії загинуть від холодового удару раніше, ніж жовток встигне захистити їх. Розбавлену сперму витримують при кімнатній температурі (18-20°С) протягом 20-30 хв. Це потрібно для того, щоб молекули лецитину з білком огорнули поверхню сперміїв й утворили своєрідну оболонку для захисту їх від швидкого охолодження.

   Розбавлену сперму бугая розфасовують у стерильні флакони зпід антибіотиків, поліетиленові або скляні ампули; сперму барана — у флакони; сперму жеребця — у скляні банки з притертими пробками або спеціальні ампули місткістю 30 мл; сперму кнура — у скляні колби або поліетиленові флакони. На всіх місткостях має бути етикетка із зазначенням клички та номера плідника, дати взяття сперми (на ампулах ці дані пишуть тушшю). Розфасовану сперму плідників (крім сперми кнура) ставлять на шар вати в термосі і через 3-4 год вату та поліетиленову плівку виймають і сперму зберігають безпосередньо на льоду. Сперму кнура після її розбавляння розріджувачем з жовтком поступово охолоджують у спеціальному термосі із швидкістю 2-4°С на годину. Колби або флакони закривають целофаном або пергаментним папером негерметично і зберігають у темному місці при відповідній температурі. Доставлена на пункти штучного осіменіння сперма бугая при правильній організації її зберігання придатна для осіменіння протягом 2-3 діб, а барана — до 1,0-1,5 доби. Використовують сперму бугая з активністю сперміїв не менш 47 як 7, баранів — 8 балів. Сперма жеребця придатна для осіменіння протягом 2 діб з активністю не нижче 5 балів, а сперма кнура — 2-3 доби та активністю 6 балів. Теоретичні основи заморожування сперми і тривале зберігання її      Тривалість зберігання сперми при температурі, близькій до 0c С, дуже обмежена. Запліднювальна здатність сперміїв уже через 3, рідше через 4-5 діб різко зменшується. Це пояснюється тим, що при плюсових температурах обмінні процеси в спермі хоча й сповільнюються, але не припиняються. По- перше, це призводить до нагромадження шкідливих продуктів розпаду, а по- друге, починається руйнування передньої частини головки сперміїв — акросоми, яка відіграє важливу роль при заплідненні яйцеклітини. Короткий строк зберігання сперми зумовлює великі труднощі в роботі підприємств і пунктів. Це пов'язано з великими транспортними витратами, оскільки один раз на 3 доби потрібно завозити сперму із племпідприємств па пункти штучного осіменіння. Взимку частина сперми на пунктах не використовується, а влітку, в період масового приходу самок в охоту, сперми часто не вистачає. Крім того, утруднюється застосування індивідуального підбору пар тварин. Строк зберігання сперми і можна збільшити способом подальшого зниження температури. Проте вже при температурі - 0,6°С сперма замерзає і спермії гинуть. Кристали льоду ушкоджують протоплазму сперміїв і її тонкі структури.    Іншою причиною загибелі сперміїв є згубна дія концентрованих розчинів цукрів і солей, які утворюються в рідкій фазі сперми внаслідок вимерзання води. Крім того, на початкових стадіях охолодження причиною загибелі сперміїв може бути холодовий удар їх.

 

3. Теоретичні основи заморожування сперми і тривале її зберігання. Перед заморожуванням сперму розбавляють середовищами, які обов'язково повинні містити жовток курячого яйця і гліцерин, а також деякі цукри. Жовток, як уже зазначалося, зменшує небезпеку холодового удару і є своєрідним осмотичним буфером, що захищає спермії від шкідливої дії концентрованих розчинів.    Гліцерин і близькі до нього сполуки — це речовини, які називаються кріопротекторами (кріофілактиками). Вони знижують точку замерзання сперми, внаслідок чого вона стає здатною до досить глибокого переохолодження. Усі методи глибокого заморожування сперми передбачають попереднє повільне охолодження і зберігання її при температурі 2-4c С протягом 2-4 год. Цей технологічний прийом називається адаптацією сперміїв (пристосування їх до низьких температур). Значення адаптації полягає в тому, що спермії при цій температурі переходять у стан неповного анабіозу і легше переносять осмотичні зміни в процесі заморожування, ніж тоді, коли обмінні процеси відбуваються на високому рівні. При заморожуванні сперми велике значення має режим її охолодження. Нині застосовують два режими: швидкий і більш повільний. Перевагу надають першому. Теоретичною основою швидкого заморожування сперми є гіпотеза про можливість склоподібного некристалічного (аморфного, вітрифікаційного) 48 затвердіння рідини. Для того, щоб досягти вітрифікації клітин, треба знати, як відбувається процес кристалізації води при замерзанні. В охолоджуваній воді утворюються зародкові центри кристалізації — скупчення молекул з малою кінетичною енергією. В'язкість води, яка зростає із зниженням температури, призводить до сповільнення теплового руху молекул, що полегшує утворення центрів кристалізації і збільшення утворених кристалів. Значне зниження температури перешкоджає переміщенню молекул у рідині, внаслідок чого припиняється утворення кристалізаційної решітки, без якої ріст кристалів неможливий. При цьому швидкість кристалізаційних процесів поступово зменшується до нуля. Нижня межа температурного інтервалу, в якому інтенсивно відбувається кристалізація при заморожуванні сперми, становить від 40 до 50c С. Якщо сперму охолоджувати повільно, то вся вода, яка міститься в ній, встигає закристалізуватись і спермії гинуть. Отже, при швидкому охолодженні сперми можна «проскочити» небезпечну температурну зону кристалізації, де протоплазма сперміїв замерзає як єдине ціле без утворення кристалів льоду і спермії не гинуть. Проте, щоб досягти вітрифікації, потрібні дуже високі швидкості охолодження. їх можна досягти при заморожуванні малих об'ємів сперми (0,1-0,5 мл). Для цього потрібні охолоджувачі з досить низькою температурою — рідкий азот, який має температуру кипіння – 196 °С. Можна також використовувати рідкий кисень (—183 °С) і твердий діоксид вуглецю — «сухий лід», температура випаровування якого дорівнює —78c С. Однак рідкий азот — найкращий охолоджувач. Склоподібний стан нестійкий і при підвищенні температури у вітрифікованій спермі можуть знову утворюватись кристали. Це зворотне явище називається девітрифікацією. Щоб запобігти йому, сперму треба зберігати при низьких температурах (нижче — 100c С), не допускаючи навіть короткочасного підвищення температури. Ось чому розморожувати сперму потрібно з максимальною швидкістю, щоб «проскочити» небезпечну температурну зону, внаслідок чого кристали льоду не встигають утворитися і сперма безпосередньо із склоподібного стану переходить у рідкий.

  Повної вітрифікації сперми можна досягти при дуже високих швидкостях охолодження (5000 c С за секунду), але практично зробити це неможливо.    Тому, мабуть, у спермі відбувається не вітрифікація, а дрібнокристалічне замерзання води, яке менш шкідливе для сперміїв, ніж утворення великих кристалів льоду при повільному заморожуванні. Загибель сперміїв при дуже швидкому охолодженні можна пояснити і тим, що в спермі багато вільної води, яку важко перевести у вітрифікований стан. У протоплазмі і ядрі самих сперміїв міститься як вільна, так і міцно зв'язана вода з білками та іншими колоїдами протоплазми. Ця вода здатна до досить глибокого переохолодження і може переходити у вітрифікований стан. Тому при заморожуванні сперми можуть одночасно відбуватись процеси кристалізації і вітрифікації. Спочатку при охолодженні сперми починається кристалізація так званої вільної води у її рідкій фазі (плазмі). Між кристалами льоду навколо сперміїв утворюється концентрований 49 розчин цукрів і солей, під дією якого з клітини виділяється вільна вода. Спермії при цьому не гинуть, оскільки за мінусових температур вони менш чутливі до гіпертонічних розчинів, ніж за плюсових. Втрата вільної води зменшує можливість утворення кристалів усередині клітин і сприяє вітрифікації протоплазми. В даному випадку процес кристалізації в плазмі сперми розглядається як позитивне явище, що сприяє вітрифікації сперміїв.

 

4.  Обладнання для заморожування, зберігання і транспортування сперми.      Сперму, яка зберігається в рідкому азоті, слід захищати від підвищення температури. Перед використанням потрібно швидке взяти сперму з рідкого азоту й перенести на водяну баню для розморожування. При підвищеній швидкості розморожування замороженої сперми збільшується кількість сперміїв, які відновлюють нормальний рух. Очевидно, в цьому випадку вдається уникнути рекристалізації протоплазми сперміїв Знання основ заморожування сперми і зберігання її при дуже низьких температурах дає змогу уникнути помилок на всіх етапах її обробки й використання. Нині широко застосовують метод тривалого зберігання сперми, замороженої в рідкому азоті (-196 c С).

  Він є основним способом зберігання сперми бугаїв. Розроблені також технології заморожування сперми баранів і жеребців. Сперму бугаїв заморожують у формі необлицьованих гранул на фторопластовій пластині, у формі облицьованих гранул, у полімерних капілярах (соломинах, пайєтах) і в поліетиленових або скляних ампулах. Перші три способи широко поширені у виробничих умовах.